La Azoospermia affligge l’1% circa dei soggetti maschi, e nella maggioranza dei casi è di natura Non-Ostruttiva. La Scienza ha da tempo dimostrato che la maggioranza di questi pazienti hanno piccoli residui di spermatogenesi all’interno dei loro testicoli. Pertanto, è doveroso ricorrere alle più efficaci procedure per consentire a questi soggetti affetti da Azoospermia Non-Ostruttiva di avere figli geneticamente propri.

L’ECCELLENZA medica nella gestione di questi soggetti si articola in tre momenti cardinali:
- la ottimizzazione del recupero chirurgico dei tubuli seminiferi probabile sede di spermatogenesi residua
- la ottimizzazione del recupero di spermatozoi dai suddetti tubuli seminiferi
- la ottimizzazione del potenziale riproduttivo di questi spermatozoi in corso di riproduzione assistita mediante ICSI

1) La ottimizzazione del recupero chirurgico dei tubuli seminiferi probabile sede di spermatogenesi residua

Tutta la Letteratura Medica oggi conferma che la modalità di recupero più efficace degli spermatozoi è la Microtese.
In merito, è doveroso qui riportare il grave danno che le coppie subiscono quando vengono immotivatamente disincentivate dall’intraprendere questo percorso, e indirizzate senza ulteriori adeguate informazioni alla fecondazione assistita con seme di donatore.

Disinformazioni più frequenti:

• “TESE e Microtese sono sostanzialmente la stessa cosa”. Non è vero! : la TESE consiste nella asportazione a occhio nudo di uno o più frammenti di tessuto testicolare a caso, mentre la Microtese asporta con tecnica microchirurgica i soli e pochi tubuli seminiferi di calibro ottimale, che come tali probabilmente ospitano spermatozoi; la prima sacrifica più tessuto testicolare, ottenendo più raramente un recupero positivo, e comunque anche questo caso una alquanto minore quantità di spermatozoi, mentre la seconda recupera più spesso e comunque un maggior numero di spermatozoi.
• “La TESE offre un recupero positivo di spermatozoi nel 50% dei casi” (questa affermazione è stata riportata su carta intestata di un importante Istituto Clinico). Non è vero! : la TESE, secondo le Meta-Analisi della Letteratura Scientifica recupera spermatozoi in media nel 35% 1 dei casi, mentre le stesse accreditano alla Microtese in media il 52% ¹ di recuperi positivi. Nelle nostre mani la Microtese ha il 55,2% di recuperi positivi ², che diventa il 58% su pazienti i cui testicoli non abbiano mai subito in precedenza un tentativo di recupero chirurgico.
• “L’Agoaspirato testicolare è utile per accertare la presenza di spermatozoi nei testicoli”. Non è vero! : l’Agoaspirato risulta positivo solo nel 18% ³ dei casi di Azoospermia Non-Ostruttiva, e l’eventuale recupero positivo è spesso inadeguato ad una crioconservazione che sia davvero successivamente utilizzabile per eseguire più cicli di ICSI. Spesso pazienti con Agoaspirato negativo hanno poi un recupero positivo di spermatozoi con Microtese. Non solo: l’agoaspirato multiplo può gravemente danneggiare il tessuto testicolare, riducendone la possibilità di un recupero positivo con Microtese, come documentato da studi anatomopatologici ⁴.
• “La Microtese è un intervento molto doloroso”. Non è vero! : l’intervento nelle nostre mani, grazie alla esperienza dell’andrologo microchirurgo ed alla tecnica ben sperimentata che usa, è sostanzialmente indolore, sia nel giorno dell’intervento che nei giorni del brevissimo decorso postoperatorio a casa (è richiesto solo un secondo giorno di moderato riposo!), come testimoniato dai commenti di numerosi nostri pazienti su vari blog o forum italiani da oltre un decennio. La maggioranza dei nostri pazienti non necessita di analgesici già il giorno successivo all’intervento.
• “La Microtese danneggia severamente il testicolo e abbassa il livello di testosterone”. La prima affermazione è falsa: controlli ecografici eseguiti a distanza non sono quasi mai in grado di far sospettare all’ecografista il precedente intervento di Microtese ⁵. La seconda affermazione va interpretata: è ovvio che la asportazione di seppur minimi frammenti di polpa testicolare non fa certo aumentare il livello di testosterone; tuttavia, gli studi scientifici dimostrano che l’abbassamento del testosterone a 18 mesi dell’intervento è solamente del 5% in media rispetto al livello preoperatorio ⁶ .

Requisiti Ineludibili per una Vera Microtese

• Il cardine della Microtese è la identificazione dei tubuli seminiferi di calibro ottimale (il diametro dei tubuli è per lo più proporzionale al loro contenuto di cellule, più sono grossi più facilmente sono pieni; i tubuli assottigliati sono usualmente del tutto privi di spermatogenesi): un tubulo seminifero normale ha un diametro di circa 200 micron, cioè un quinto di mm. Pertanto, è imprescindibile poter disporre in sala operatoria di adeguate ottiche di ingrandimento, perché solo grazie a queste un occhio molto esperto può selezionare in base a minime differenze di calibro i tubuli più probabile sede di spermatogenesi residua. L’ingrandimento minimo a cui è doveroso operare è x24 (noi operiamo a x36). Ingrandimenti inferiori portano a risultati alquanto inferiori: è quindi da scartare a priori l’uso di loupes (occhialini microchirurgici che ingrandiscono solo da x4 a x7).
• Un altro requisito ineludibile è la esperienza dell’andrologo microchirurgo nel settore specifico della Microtese. Già nel 2010 un Esperto giapponese aveva pubblicato uno studio scientifico da cui emergeva la necessità di un lungo apprendimento, cioè della necessità di eseguire almeno 150 Microtese prima di ottenere risultati decorosi ⁷. Il prof. Schlegel, ideatore della Microtese, stabilisce la necessità di almeno 500 Microtese per considerarsi al top ⁸ (chi scrive, ad aprile 2023, aveva eseguito personalmente oltre 1700 Microtese).
• Il terzo elemento è la disponibilità della sala operatoria per un adeguato periodo di tempo. La Microtese è un intervento delicato su cui alla fine si basa ogni speranza di un paziente con Azoospermia Non-Ostruttiva di avere un figlio geneticamente proprio. Pertanto, la ricerca microchirurgica deve essere estremamente attenta, e conseguentemente l’intervento deve essere sufficientemente lungo. Non è possibile eseguire una vera Microtese impiegando mezz’ora circa per ciascun testicolo!
• L’ultimo requisito indispensabile è la presenza del Biologo Esperto in sala operatoria. L’Andrologo Microchirurgo asporta via via qualche tubulo e il Biologo esperto deve esaminarlo subito e deve fornire un riscontro immediato al Chirurgo operatore. Per tutta la durata dell’intervento deve esserci una ininterrotta interazione reciproca di informazioni tra Andrologo Microchirurgo e Biologo Esperto.
  
  

2) La ottimizzazione del recupero di spermatozoi dai suddetti tubuli seminiferi

• La ricerca di spermatozoi dai tubuli seminiferi asportati si articola in due fasi. Nella prima il Biologo Esperto sminuzza parzialmente il tubulo e lo osserva al microscopio a x 400 ingrandimenti, informando il Microchirurgo sulla presenza di spermatozoi, di cellule germinali precursori degli spermatozoi o di altre tipologie di cellule. In questo modo si orienta la ricerca del Microchirurgo sulla necessità o meno di esplorare diverse aree del testicolo o di dover procedere sul testicolo controlaterale.
• In una seconda fase tutti i micro-frammenti di tubuli seminiferi asportati vengono ulteriormente sminuzzati in un medium di coltura fino ad ottenere la completa dissociazione del tessuto per liberare gli spermatozoi eventualmente presenti.
  Per questo motivo potrebbe esserci un recupero negativo nella fase a), che diventa positivo nella fase b).  La ricerca e la raccolta degli spermatozoi è un processo che richiede tempo ed esperienza specifica. Inoltre, l’uso nel nostro Centro di un trattamento enzimatico idoneo a dissociare le cellule in modo meno traumatico rispetto al sistema standard ci ha permesso di quadruplicare il numero di spermatozoi vitali raccoglibili ⁹.  Gli spermatozoi, una volta raccolti, vengono opportunamente ripartiti in paillettes e crioconservati, in modo che ogni paillette risulti idonea per un ciclo di ICSI.     
• Nel nostro Centro, da poco più di due anni, proponiamo alle coppie di eseguire la Microtese sincrona con il pick-up degli ovociti: questo permette di eseguire una ICSI con ovociti freschi e spermatozoi freschi, aumentando significativamente per la coppia le possibilità di ottenere una gravidanza (vedi oltre).
• Gli spermatozoi recuperati in esubero vengono poi congelati per un eventuale uso futuro in caso di necessità.
  
  

3) La ottimizzazione del potenziale riproduttivo di questi spermatozoi in corso di riproduzione assistita mediante ICSI

• Strategie di preparazione degli spermatozoi recuperati
  Prima di essere utilizzati direttamente per la ICSI, gli spermatozoi recuperati dal campione bioptico sono trattati con gradienti di densità discontinuo.
  Tale tecnica di preparazione presenta una triplice funzione:
  • Seleziona gli spermatozoi con le migliori caratteristiche di mobilità e morfologia, in quanto solo questi ultimi saranno in grado di migrare attivamente attraverso i diversi strati del gradiente sul fondo della provetta;
  • Favorisce la capacitazione spermatica attivando la reazione acrosomiale, due processi biologici fondamentali per la fecondazione degli ovociti;
  • Rimuove componenti cellulari (globuli rossi, cellule rotonde, spermatozoi degenerati, ecc.) che potrebbero generare molecole (quali i ROS) in grado di danneggiare il DNA e la membrana plasmatica degli spermatozoi vitali.
  Il preparato risultante dal gradiente di densità è addizionato con attivatori del metabolismo cellulare in grado di migliorare la funzionalità degli spermatozoi in vitro, stimolandone la motilità.
  A questo punto, il Biologo Esperto seleziona gli spermatozoi in base a criteri di motilità e morfologia prima di procedere alla ICSI (microiniezione degli spermatozoi negli ovociti maturi).
  Questi trattamenti permettono di avere dei risultati di fecondazione degli ovociti simili a quelli risultanti da trattamenti con spermatozoi da seme eiaculato.
• Strategie di coltura
  • L’uso di un Incubatore e microscopio in modalità TimeLapse permette un monitoraggio ed una registrazione in modalità continua dello sviluppo embrionale, mantenendo stabili le condizioni di coltura ed incrementando in tal modo la sopravvivenza degli embrioni.
  • La coltura degli embrioni viene prolungata fino al quinto-sesto giorno, cioè fino a quando viene raggiunto lo stadio di blastocisti. Per un meccanismo spontaneo di selezione naturale, alcuni embrioni possono interrompere il loro processo evolutivo di divisione cellulare prima dei cinque – sei giorni dalla fecondazione. Per questo è importante evitare trasferimenti di embrioni in seconda-terza giornata, cioè di embrioni magari destinati a non svilupparsi, ma causando con transfer anticipati spese ed aspettative inutili alla coppia. Questa strategia consente di aumentare di fatto il tasso di impianto embrionario ed il tasso di gravidanza per transfer.
• Strategie di stimolazione ovarica con Embryo Transfer differito
  La esperienza clinica dimostra come sia spesso meglio crioconservare le blastocisti ottenute, e trasferirle ad una ad una in cicli successivi a quello del pickup ovocitario, dopo aver ogni volta preparato l’endometrio con farmaci allo scopo di renderlo più “accettivo” all’impianto. Questo modo di procedere consente di raggiungere tassi di gravidanza evolutiva cumulativa per coppia estremamente elevati.
  
  

CONCLUSIONI: Nel caso la gravidanza sia ottenuta, come spesso succede, dopo il trasferimento della prima o della seconda blastocisti, la coppia avrà a disposizione, crioconservate, altre eventuali blastocisti, a cui ricorrere in un tempo successivo per ulteriori gravidanze.
In sostanza, ogni blastocisti trasferita offre una rilevante possibilità di gravidanza evolutiva (vedi il grafico). E in caso di utilizzo positivo o negativo di tutte le blastocisti ottenute col primo pick-up ovocitario, la coppia puo’ ripetere altri pick-up (se necessario) ricorrendo all’uso degli spermatozoi in esubero dalla Microtese e crioconservati (usualmente ogni paillette di spermatozoi crioconservati è sufficiente per nuovo un ciclo di ICSI).

BIBLIOGRAFIA

1 Bernie, A.M.; Mata, D.A.; Ramasamy, R.; Schlegel, P.N. Comparison of Microdissection Testicular Sperm Extraction, Conventional Testicular Sperm Extraction, and Testicular Sperm Aspiration for Nonobstructive Azoospermia: A Systematic Review and Meta-Analysis. Fertil. Steril. 2015, 104, 1099–1103.

2 Colpi G.M.; Caroppo E.: Performing Microdissection Testicular Sperm Extraction: Surgical Pearls from a High-Volume Infertility Center. J. Clin. Med. 2021, 10, 4296-4308.

3 Bernie, A.M.; Mata, D.A.; Ramasamy, R.; Schlegel, P.N. Comparison of Microdissection Testicular Sperm Extraction, Conventional Testicular Sperm Extraction, and Testicular Sperm Aspiration for Nonobstructive Azoospermia: A Systematic Review and Meta-Analysis. Fertil. Steril. 2015, 104, 1099–1103.

4 Shufaro, Y.; Prus, D.; Laufer, N.; Simon, A. Impact of repeated testicular fine needle aspirations (TEFNA) and testicular sperm extraction (TESE) on the microscopic morphology of the testis: An animal model. Hum. Reprod. 2002, 17, 1795–1799.

5 Colpi, G.M.; Piediferro, G.; Scroppo, F.I.; Colpi, E.M.; Sulpizio, P. Surgery for Male Infertility: Surgical Sperm Retrievals. In: Clinical Andrology. Bjorndahl, L., Giwercman, A., Tournaye, T., Weidner, W., Eds.; Informa Healthcare: New York, NY, USA, 2010; pp. 148–162.

6 Schlegel, P.N.; Su, L.M. Physiological consequences of testicular sperm extraction. Hum. Reprod. 1997, 12, 1688-1692.

7 Ishikawa, T.; Nose, R.; Yamaguchi, K.; Chiba, K.; Fujisawa, M. Learning curves of microdissection testicular sperm extraction for nonobstructive azoospermia. Fertil. Steril. 2010, 94, 1008–1011.

8 Dabaja, A.A; Schlegel, P.N. Microdissection testicular sperm extraction: an update. Asian J. Androl. 2013 Jan;15(1):35-9.

9 Piatti E., Colpi E.M., Caminiti G.,Castiglioni F., Bernasconi E., Testa P., Monti V., Bellavia M., Momi G., Colpi G.M. Enzymatic digestion by Collagenase-IV improves quality of testicular sperm retrieved in Non-Obstructive Azoospermic (NOA) patients. ESHRE, 2020, Book of Abstracts P-046.